原核生物中的获得性免疫系统CRISPR-Cas系统（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)-associated systems）可以在向导RNA的指导下特异性的靶向长度20~40nt的目标核酸片段，在开发核酸检测技术上具有天然优势。不同CRISPR-Cas系统中，III型CRISPR-Cas10系统具有多重免疫活性，其中目标RNA激活的非特异性核酸酶活性（旁切活性）具备开发RNA病毒以及新型癌症标志物小RNA（microRNA, miRNA）的检测技术的潜力。山东大学微生物技术国家重点实验室的佘群新教授团队对多种III型CRISPR免疫系统进行了系统性的研究，揭示了一系列的免疫机制。研究表明，在目前世界上已鉴定的该类免疫系统中，只有保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）所编码的（Ld）Csm系统具有很强的RNA激活的DNA旁切活性，非常适合于构建基于该旁切活性的核酸检测平台。我们在International Journal of Molecular Sciences期刊发表了题为“Harnessing the LdCsm RNA Detection Platform for Efficient microRNA Detection”的研究论文，介绍了基于LdCsm系统的RNA检测技术，并对乳腺癌相关小RNA进行了高效检测。该技术还具有进一步开发为小RNA即时诊断工具的潜力，对于早日实现癌症诊断具有重要意义。

LdCsm RNA检测平台的基本原理。(a)LdCsm系统的表达及效应复合物的组装过程示意图；(b)基于LdCsm系统的RNA检测反应示意图。

LdCsm RNA检测系统对乳腺癌相关小RNA miR-155的检测。(a)不同LdCsm-dCsm3复合物中crRNA（引导RNA）

的示意图；(b)两种LdCsm-dCsm3复合物检测miR-155 的荧光曲线；(c)优化crRNA 5’-repeat tag增强了

对miR-155的检测效率；(d)对miR-155的检测极限；(e)对miR-155的选择性。

本研究中，我们建立了一种基于LdCsm-dCsm3系统的RNA检测平台，测试并优化了其用于癌症相关小RNA检测的效率，首次尝试使用III型CRISPR-Cas10系统对小RNA进行检测。该系统依赖于LdCsm-dCsm3复合物由目标RNA激活的DNase活性，通过切割荧光-淬灭ssDNA报告子释放检测信号。通过与LwaCas13a RNA检测系统的比较，发现该系统对来自非特异性RNA的干扰的抵抗能力更强，在常温下储存稳定性更好（对冷链运输依赖程度低）。用于乳腺癌相关小RNA miR-155的检测时，该系统对miR-155显示出了远超其他小RNA的特异性。经过对LdCsm-dCsm3复合物中引导RNA 5’-repeat tag序列的改造，使其检测效率提高了3.9倍，对血清中miR-155的检测极限达到了2nM。这些结果都说明LdCsm-dCsm3 RNA检测平台有潜力开发为新一代的小RNA即时诊断工具。

佘群新团队的于振霄博士为该研究的第一作者，佘群新教授为该研究的通讯作者，佘群新团队的科研助理徐佳楠参与了部分研究工作。山东大学微生物技术国家重点实验室为第一作者单位和通讯作者单位。

该研究得到了中华人民共和国科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金和中国博士后科学基金等基金的资助。山东大学微生物技术国家重点实验室公共技术平台为该研究提供了技术支持。

原文链接：https://www.mdpi.com/1422-0067/24/3/2857/htm