生产高效、低成本的木质纤维素酶对于植物细胞壁资源的生物转化具有重要意义。丝状真菌在工业上主要用于生产木质纤维素酶(如纤维素酶和木聚糖酶)，这些酶的表达受到一系列转录因子的严格调控。因此，设计转录因子的活性已被证明是提高几种真菌中木质纤维素酶产量的有效策略。里氏木霉是最广泛使用的纤维素酶和木聚糖酶的工业生产者之一，在里氏木霉中，转录因子XYR1激活了纤维素酶和木聚糖酶基因的大部分表达。XYR1在木质纤维分解酶诱导剂(如槐糖)的作用下诱导合成的，并通过招募中介复合体和RNA聚合酶II来激活其靶基因的转录。在黑曲霉中也报道过XYR1同源蛋白的另一种活性突变体。然而，由于对XYR1的作用机理认识不清，目前XYR1的工程化还缺乏合理的策略。
图1. 通过AlphaFold2预测结构提高里氏木霉木质纤维素酶生产
2023年11月22日，本团队 刘国栋等 在《Synthetic and Systems Biotechnology》 杂志发表了题为 “Structure-guided engineering of transcriptional activator XYR1 for inducer-free production of lignocellulolytic enzymes in Trichoderma reesei”的研究论文，在这项研究中，研究者通过AlphaFold2预测的XYR1丙氨酸873的结构，确定了丙氨酸873是里氏木霉XYR1基因工程活性的潜在靶点，并对该位点进行了随机突变，获得了一个新的结构性活性突变体。研究比较了突变株和出发菌株的木质纤维素酶的表达方式，并对突变株产生的酶对木质纤维原料的水解率进行了研究，发现该残基突变为酪氨酸使木聚糖酶在以纤维素为碳源的培养基中的产量显著提高。这些结果有助于理解XYR1调控的分子机制，并为提高里氏木霉生产木质纤维素酶的能力提供了一种全新的策略。
图2. 里氏木霉XYR1 C末端结构域的结构
图3. XYR1 A873在里氏木霉中的诱变
接下来，研究者利用CRISPR/Cas9得到了XYR1活性突变体XYR1 A873Y。研究者使用CRISPR/Cas9对里氏木霉xyr1的A873密码子进行随机突变。得到突变株后，将亲本菌株和突变菌株在纤维素酶培养基上进行培养，比较了培养上清液在12 h内的差异。结果表明丙氨酸873对XYR1的功能确实重要，而A873Y是XYR1的一个新的突变体，它促进了里氏木霉分泌蛋白的产生。
图4. XYR1突变株在2 %(w/v)纤维素培养基上产木质纤维素酶
研究人员进一步对突变株木质纤维素酶的产量进行了研究。研究者对突变株A873Y和出发菌株QMP的纤维素酶和半纤维素酶的产生量进行了比较。A873Y在2 %(w/v)纤维素酶介质中培养168 h后，胞外木聚糖酶活力达到QMP的6.7倍，其β-木糖苷酶和α-阿拉伯糖苷酶活性分别为是出发菌株的102.1倍和5.7倍。在A873Y中，BXL1和XYN1/XYN2(21 kDa)对应的蛋白条带也显著增加。结果表明，A873Y突变显著增加了与木聚糖降解相关的半纤维素酶的产量。研究人员还发现了木质纤维素裂解酶在A873Y突变体中不需要诱导剂即可表达。类似于前人研究的XYR1V821F和XYR1A824V表达均使得木质纤维素酶能够在葡萄糖存在的情况下产生，研究者对A873Y突变株在2 %(w/v)葡萄糖培养基中的产酶能力进行研究，并发现XYR1A873Y突变株在无诱导剂条件下具有激活木聚糖酶和纤维素酶生产的能力，且A873Y突变株的木质纤维素酶产量高于V821F突变株。
图5. XYR1突变株在2%(w/v)葡萄糖中培养120h产生木质纤维素酶
接下来，研究人员对A873Y突变株木质纤维素酶基因转录丰度的变化进行了探究。研究者检测了4个具有代表性的木质纤维素酶基因的转录水平。观察到所有四个基因在纤维素介质中的转录水平相对于出发菌株都有所增加，这表明在该突变体中观察到的产酶增加是由于相应基因的较高mRNA水平。结果还证实了XYR1A873Y比XYR1V821F具有更强的提高木质纤维素酶表达的能力。
图6. xyr1突变对木质纤维素酶编码基因转录水平的影响
研究人员进一步对A873Y突变可能导致的XYR1构象变化进行了推测。为了研究A873Y突变可能引起的XYR1结构的变化，对野生型和突变的结构进行了分子动力学模拟。结果突出了两个模型之间的实质性构象差异。在对构象差异分析之后，研究者又对A873Y突变株产生的粗酶对木质纤维素的降解性能进行了研究。研究者测试了粗酶对玉米纤维的水解率，结果表明，A873Y粗酶比QMP粗酶多产生79 %的半乳糖，51 %的葡萄糖和52 %木糖的，阿拉伯糖作为次要产物的浓度降低了17 %，且突变株A873Y的水解液中纤维二糖的浓度明显低于QMP。
图7. XYR1野生型和A873Y突变体的结构比较
在本研究中，研究者根据AlphaFold2预测的XYR1结构，在里氏木霉中发现了一个新的活性突变体XYR1A873Y。在无诱导剂的条件下，该突变株的木聚糖酶产量显著提高，木质纤维素酶的表达也得到了激活。该突变株产生的粗酶对玉米纤维和玉米秸秆的糖化效果优于亲本菌株。这些发现为提高里氏木霉木质纤维素酶系统的产量水平和性能提供了一种有效的策略。微信公众号
