CO₂是重要的温室气体，其过量释放会导致温室效应，引起全球性的气候变化，降低大气中CO₂的净排放量已成为全世界面临的一项迫切任务。利用生物技术将CO₂转化为高附加值的燃料或化学品等是一个双赢的策略：不仅可以减少CO₂排放，而且可以为生物合成提供几乎免费的碳源。

丙酰辅酶A羧化酶（propionyl-CoA carboxylase，PCC）是一类广泛存在于各种生物中的生物素依赖酶，可以催化丙酰辅酶A与CO₂反应生成甲基丙二酸单酰辅酶A。该酶由生物素羧基载体蛋白、生物素羧化酶和羧基转移酶（carboxytransferase，CT）三个亚基组成，酶活力、底物特异性等基本由其核心亚基CT决定。除CO₂生物固定外，PCC还在人体酮酸代谢、红霉素等天然产物合成中发挥着重要作用。目前已知的PCC活力较低，成为限制其应用的关键瓶颈问题。

图1 基于草酰乙酸营养缺陷型的PCC高通量筛选系统

为获得高催化能力的PCC，我们在大肠杆菌中克隆、表达和纯化了7种不同来源的CT亚基蛋白，建立了其体外酶活测定方法，比较了不同来源CT亚基的酶活性，发现枯草芽孢杆菌来源的PCC CT亚基表现出最高的催化能力。为利用定向进化技术进一步提升其酶活性，我们设计了基于草酰乙酸营养缺陷型的遗传选择系统，用于CT亚基突变体的高通量筛选：通过敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc、苹果酸脱氢酶基因mdh、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pck，构建草酰乙酸营养缺陷型大肠杆菌，其在基础培养基中无法生长；通过异源表达甲基丙二酰辅酶A 羧基转移酶基因mct 及PCC基因，构建草酰乙酸互补合成途径，将PCC的催化能力与宿主菌在基础培养基中的生长状况进行关联。经过PCC随机突变文库的筛选，发现四种单突变体（D46G、L97Q、N220I和I391T）对酶催化活性的提升有较大帮助；经过单突变体的随机组合及筛选，最终N220I/I391T组合突变体的综合催化效率（k_cat/K_m）较野生型提高94倍。

图2 高效二氧化碳固定的琥珀酸合成新途径及其与传统途径的比较

接下来，我们利用获得的高活性PCC突变体构建了高效固定CO₂合成琥珀酸的新途径。该途径由乙酰辅酶A出发，分别利用乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和PCC固定两分子CO₂，最终合成琥珀酸。我们在工程菌培养基中加入了¹³C同位素标记的NaHCO₃，最终产生了大量带有两个¹³C原子的琥珀酸，验证了该途径的可行性；又通过宿主菌中产物消耗基因的敲除、代谢压力的优化等，大幅度提高了琥珀酸的产量。琥珀酸是一种重要的平台化合物，被美国能源部列为最重要的12种生物基平台化合物之一。与传统的丙酮酸羧化生产琥珀酸途径相比，该途径具有更高的CO₂固定能力，同时不需要严格的厌氧环境。

综上所述，本研究不仅获得了一种在生物技术领域中有广阔应用潜力的高催化能力的PCC突变体，还为琥珀酸的高效生物合成提供了新思路。本研究成果发表于Metabolic Engineering期刊，博士生刘修涛为论文第一作者。

论文链接：Liu XT, Feng XJ, Ding YM, Gao WJ, Xian M, Wang JC*, Zhao G*. Characterization and directed evolution of propionyl-CoA carboxylase and its application in succinate biosynthetic pathway with two CO₂ fixation reactions. Metab Eng, 2020, 62: 42-50. DOI: 10.1016/j.ymben.2020.08.012.