随着合成生物学与基因编辑技术的发展，在科学研究中需要编辑越来越多的基因，例如为了构建特定功能的菌株需要进行多轮的基因编辑，而且往往需要通过不同基因编辑的组合构建大量菌株进行“试错”筛选。现有基因编辑方法需要引入特定筛选标记或者特定抗性的质粒来完成基因编辑，这些筛选标记或者质粒需要在下一轮基因编辑前去除，从而实现无痕编辑或者筛选标记的重复利用。而筛选标记或者质粒的去除效率很难达到100% （即会发生逃逸），因此在去除标记后需要进行单克隆的筛选和确认。这极大地增加了多轮基因编辑的周期，而且需要更多的培养次数、增加了基因组自发突变的风险。

图1. 基于“剪刀石头布”策略的多基因编辑方法示意图。A. 三个能够循环消除的基因编辑辅助质粒，在实施基因编辑的同时能消除上一轮的质粒。 B. 相较于传统方法，本方法不需要单独的筛选标记或质粒消除步骤。

针对这个问题，本课题组基于“剪刀石头布”策略实现了免筛选标记/质粒消除步骤的多轮基因编辑方法，相关成果近日发表于国际高影响刊物Nucleic Acids Research。本研究构建了三个能够循环消除的基因编辑辅助质粒（pRock，pPaper，pScissors），在按照“剪刀-石头-布”顺序分别使用这三个质粒实施基因编辑时，可以同时去除上一轮基因编辑中使用的辅助质粒，从而免除了传统方法中的筛选标记或者质粒消除步骤，极大地提高了多轮编辑的速度。质粒消除效率可达到99.99-100%，几乎不会有逃逸情况。另外该系统还存在双重检查机制：如上一轮发生了逃逸的情况，由于质粒间的拮抗作用则不能进行下一轮编辑。本研究在大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌中对该方法进行了测试，快速完成了多轮的敲除、插入、替换等基因编辑操作。

图2. 基于“剪刀石头布”策略的多轮基因编辑流程图。A. “剪刀石头布”基因编辑辅助质粒构建流程图。B. 连续多轮基因编辑步骤流程图。

利用本方法进行连续多轮基因编辑时，每一轮编辑仅需要进行两次培养，即一次平板培养和一次单克隆液体培养，这几乎是精细基因编辑所需要的最少培养次数。这不仅极大地缩短了基因编辑周期，还减少了基因组随机突变的可能性，这些优势在进行大规模多轮基因编辑时尤为明显。本方法是目前最快最鲁棒的多轮基因编辑策略，可与现有其它CRISPR/Cas9编辑优化策略进行联合使用并且在未来更易于实现自动化，同样策略也可以用于其它物种的基因编辑。

本研究相关质粒可从第三方开放获取：MolecularCloud (www.molecularcloud.org)，MC_0101139, MC_0101140，MC_0101141。建议同时获取MC_0000011以及MC_0000012。

论文链接：Wang JC, Sui XY, Ding YM, Fu YX, Feng XJ, Liu M, Zhang YM, Xian M*, Zhao G*. A fast and robust iterative genome-editing method based on a rock-paper-scissors strategy. Nucleic Acids Res, 2020, DOI: 10.1093/nar/gkaa1141.